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NCBI设计引物的网站解读_磁滞回线实验数据及图表(2024年11月精选)

内容来源：我赢网所属栏目：新闻更新日期：2024-11-27

NCBI设计引物的网站

如何设计qPCR引物：实用指南大家好！今天我们来聊聊如何设计qPCR（定量PCR）的引物。其实，qPCR的引物设计和普通PCR差别不大，都可以用NCBI来方便地设计。不过，由于qPCR鉴定的是mRNA的表达，所以在设计引物时需要特别注意以下几点：第一步：打开NCBI 首先，打开NCBI（美国国立生物技术信息中心）网站，搜索你需要的基因（例如Lepr）。第二步：找到基因卡片点开基因卡片，找到最下方的mRNA和Protein描述。根据你的需求选择合适的Isoform，然后复制NM码。第三步：进入引物设计页面在NCBI的引物设计（Primer design）栏目输入刚才复制的NM码。我个人更喜欢下载cDNA文件，然后用SnapGene手动拉取引物，这样可以直接看到cDNA序列，更加直观。第四步：确认引物CG值在SnapGene中确认引物的CG值（大约50%），Tm值在60度左右。可以多设计几对引物，以防有些引子不工作。希望这些小技巧能帮到大家，祝科研顺利！𐟒ꀀ

研0小白的引物设计之路：从零开始摸索实验 𐟔 被引物设计困扰的一天加入课题组已经三个月了，但我对实验流程的了解还不够深入。临近开学，我开始感到焦虑。最近，我决定尝试设计一个目的基因的引物，看看是否能得到一些结果。第一步就是订购引物。 𐟓… 实验的初步尝试上午，我在小破站和百度上看了很多关于如何设计引物的教程，希望能找到最佳的引物设计方法。下午，我尝试使用各种在线工具来筛选和验证引物的特异性。我还向师兄师姐们请教了相关问题。尽管在订购环节遇到了小麻烦，因为周末生工不上班，但我还是学会了如何筛选和设计引物，这让我感到非常有成就感。 𐟓 引物设计的方法总结在ncbi.nlm.nih.gov网站上查询基因序列，选择human的基因，找到NM号，点击右侧的“pick primers”，设定产物大小为80-250bp（推荐80-150bp），Tm值设定为60℃，选择跨外显子，提交后会出现10个引物，选择长度在18-24bp之间，GC%在40%-60%之间，self complementarity小于5的引物进行blast验证。在primerbank中查找已有的引物，然后进行blast验证。使用primer3plus工具设计引物，需要从ncbi中复制CDS序列，设计出引物后进行blast验证。 𐟔젦Ž夸‹来的实验计划接下来，我将收集血标本进行mRNA测序，并学习数据分析方法，看看这个基因的选择是否合适。虽然今天被引物设计困扰了一天，但我也学到了很多新知识，这让我对接下来的实验充满了期待。

𐟧쥼•物设计全攻略✨ 𐟔 打开PubMed网站，点选NIH，开始你的基因探索之旅！ 𐟒ᠩ€‰择“Gene”，输入你心仪的目的基因，比如mouse、rat或human哦～ 𐟑€ 点击基因名字，进入下一步，别急！ 𐟌 点击NCBI，连接世界基因库，轻松获取信息。 𐟓– 在mRNA and protein区域，找到并点击第一个序号。 𐟒𜠧‚𙥇𛃄S，进入关键步骤，别错过！ 𐟓 复制棕色序列，一定要全部复制，这是关键数据哦！ 𐟚€ 打开生工网站，选择技术服务-常规引物合成，开始你的引物设计之旅！ 𐟖寸点击在线生成引物，选择SYBR，让引物设计更精准。 𐟌 选择物种，输入基因名称，粘贴刚才复制的序列，提交你的设计！ 𐟎‰ 在引物设计列表中查看已提交的序列，等待奇迹出现吧！

𐟌𑠥𜕧‰騮𞨮᥅覔𛧕导š从理论到实践！引物设计的基本原则 𐟓œ 选择目的基因的共有外显子区域进行设计。引物长度建议在20到25bp之间，GC含量保持在40%到60%，Tm值最好在60℃左右。设计引物时，尽量跨越外显子，上下游引物可以位于不同的外显子上。引物的self complementarity和self 3' complementarity相加值应不超过8，单个值不超过5。扩增产物长度建议在80到300bp之间，最佳为80到150bp。避免设计含有4个或以上相同碱基（如AAAA、TTTT、GGGG、CCCC）的引物，以及避免明显的二级结构。设计流程 𐟖寸使用NCBI在线设计工具：进入NCBI网站，搜索目的基因（如GAPDH）。查看详细信息，找到共有外显子区域。选择转录本信息，查看外显子位置。进入引物设计页面，填写相关信息。设置引物参数，如PCR产物大小、跨越外显子等。点击“Get Primers”获取引物序列。结果解读 𐟓Š 在Graphical view of primer pairs部分查看每对引物跨越外显子的情况。在Detailed primer reports部分查看引物质量和匹配情况。通过以上步骤，你就可以轻松完成引物设计啦！𐟎‰

𐟧쐃R与RT-PCR的探秘之旅𐟔 𐟔쥜觔Ÿ物技术的广阔天地里，PCR与RT-PCR都是不可或缺的工具。最近，我深入探索了这两种技术，尤其是RT-PCR，它究竟有何魅力呢？ 𐟒ᩦ–先，RT-PCR与PCR的融合，使得在单个EP管中就能完成逆转录和聚合酶链式反应，这无疑大大简化了操作步骤。然而，这一步也带来了不小的挑战。每次转录一个RNA分子就需要消耗一个逆转录酶，这无疑增加了实验的成本和复杂性。 𐟓š在NCBI的网站上，我找到了许多关于RT-PCR的详细资料。虽然我在理解引物设计方面还有一些疑惑，比如如何选择合适的exon-exon进行设计，以及克隆时如何间接设计引物等。但我相信，随着不断的探索和学习，这些难题都将迎刃而解。 𐟒ꦀ𛧚„来说，RT-PCR以其独特的优势在生物技术领域占据了一席之地。虽然它的一些缺点也让实验者头疼不已，但正是这些挑战激发了我们的探索欲望。 𐟔–PS：在学习之余，也别忘了欣赏一下美丽的风景，比如《铃芽之旅》中的美景，它们也能给我们的心灵带来愉悦和放松哦！

5种常见溶解曲线错误及解决方法大家好，今天我们来聊聊荧光定量PCR（qPCR）中常见的五种溶解曲线错误及其解决方法。溶解曲线下滑 𐟓‰ 当溶解曲线的平台期出现得太晚，求导时可能会出错。这通常是因为产物过长或GC含量过高导致的。解决方法是更换引物，避开高GC序列，选择较短产物的引物。宽峰问题 𐟏ž️ 有时你会发现溶解曲线的峰比其他人跑出来的要“胖”，但又是单峰。这其实是宽峰由几个峰叠加形成，出现了与产物TM值相近的非特异性产物。解决办法是重新设计引物，并在NCBI上进行Blast比对，选择特异性好的引物。双峰现象 𐟏”️ 当非特异峰出现在特异峰左侧时，可能是扩增出引物二聚体；当非特异峰出现在特异峰右侧时，则是出现了非特异性产物。解决方法首选重新设计引物，或者降低引物用量，更改实验程序。阴性对照起峰 𐟌꯸ 如果实验结果中发现阴性对照（NTC）起峰，不要慌张，这并不意味着引物不能用。查看实验样品的溶解曲线，如果只有一个产物特异峰，说明引物二聚体会在没有模板时产生，加入模板后，引物二聚体的产生会受到抑制。无溶解曲线 𐟚늦œ‰时你可能发现结果中只有扩增曲线，没有溶解曲线。这可能是因为仪器没有设置溶解曲线的程序。不同仪器的溶解曲线程序可能有所不同，需要手动添加。溶解曲线的原理 𐟌᯸ qPCR程序结束后，将温度升到95℃，DNA开始解链，DNA的小沟区域也逐渐消失，SYBR Green从小沟区域释放出来，荧光信号值开始逐步降低。当温度达到产物解链一半时的温度，即Tm值时，SYBR Green大量游离出来，荧光信号值会突然下降达到0，这就是溶解曲线的来源。原始曲线进行导数分析后，溶解曲线会变成一个峰。了解这些原理后，你就能更快地解决上述问题了。溶解曲线的Tm值是溶解曲线中的重要参数，在使用同一qPCR试剂下，目标基因溶解曲线的Tm值由其产物长度和GC含量决定。只要不改变qPCR试剂，其TM值不会发生改变。因此，如果引物不会扩增出非特异性产物，就只会有一个峰；存在多个非特异性产物时，就会有多峰的情况产生。

PCR引物设计指南：关键步骤详解 𐟓š 1. 𐟔 引物设计在保守区：选择模板cDNA的保守区设计引物，这是PCR成功的关键。通过在NCBI上搜索不同物种的同一基因，并使用序列分析软件（如DNAman）进行比对，找出基因的保守区。 𐟓 引物长度适中：引物长度通常在15~30碱基之间，推荐使用18-27bp，避免过长导致延伸温度过高，影响Taq DNA聚合酶的反应。 𐟌᯸ GC含量优化：引物的GC含量应在40%~60%之间，并确保上下游引物的GC含量相近。引物的Tm值（解链温度）应接近72℃，以提高复性条件。 𐟚렩🥅密码子第3位终止：如果扩增编码区域，引物的3′端不应终止于密码子的第3位，因为这可能会影响扩增的特异性和效率。 𐟏… 3′端选择T：引物3′端选择T比A更佳，因为T的错配效率较低，而A即使在错配时也能引发链的合成。 𐟌 碱基随机分布：引物序列在模板内应随机分布，避免3′端有连续的G或C，以减少错误引发的可能性。 𐟔„ 避免引物互补：引物自身及引物之间不应存在互补序列，以防止引物折叠成发夹结构或形成二聚体，影响PCR反应。 𐟔砨𐃦•𔢖𓇥€𜯼š如果引物二聚体和发夹结构不可避免，应尽量调整其△G值，使其小于4.5kcal/mol，以减少引物二聚体的产生。

科研必备：7款高效引物设计软件推荐在引物设计领域，有多款优秀的软件可供选择，这些软件各具特色，能够满足不同科研需求。以下是几款备受推崇的引物设计软件，助你轻松搞定引物设计！ Primer Premier 𐟌 特点：Primer Premier是一款功能强大的引物设计软件，由加拿大的 Premier公司开发。它支持自动搜索引物，并将引物分析结果显示出来。其自动搜索功能以Premier为最强且方便易用，同时该软件还具备PCR或测序引物以及杂交探针设计功能。版本：常用的版本包括 Primer Premier5和 Primer Premier6,其中 Primer Premier5.0被许多用户认为是经典且好用的版本。功能：除了引物设计外，Primer Premier还包含序列编辑、酶切分析、DNA基元查找和同源性分析等功能。 Oligo 𐟔슧‰𙧂𙯼šOligo是另一款专业的引物设计软件，其分析评价功能在同类软件中表现突出。它主要用于引物探针的设计、引物探针的验证，以及合成基因和各种探针等。版本：Oligo6和Oligo7是较为常见的版本，用户可以根据需求选择合适的版本。功能：Oligo软件基于最近邻热力学数据，拥有低聚糖的搜索算法，可以精准分析TM和内部稳定性，绘制溶解温度图和稳定性图，并帮助用户找到最佳的引物PCR。 Primer Express 𐟌€ 特点：PrimerExpress是一款专门用于设计引物和探针的软件，尤其擅长荧光PCR探针的设计。功能：它包含自动设计和手动设计两种方式，能够精确计算寡核苷酸与荧光基团鳌合后的Tm值，并预测引物与引物之间、引物与模板之间的二级结构。 Beacon Designer 𐟌 特点：Beacon Designer是 PREMIER生物软件公司研发的qRT-PCR引物设计和探针设计软件，支持多达5组目标基因的多重实时PCR分析设计，功能强大且简单易用。功能：它可以设计分子信标和TaqMan探针等，所设计的探针可用于多元和等位基因鉴定实验。该软件还能自动避免交叉同源性和模板结构，检测与扩增引物间形成的交叉二聚体，防止多元反应之间的竞争。 Primer3 𐟌 特点：免费开源的在线工具，设计普通PCR引物的常用工具之一，支持批量设计引物。Primer3为PCR引物设计提供了第一个免费、可靠和通用的工具，满足了不同应用的需求。功能：Primer3的设计提供了许多选项来控制引物的位置、大小、GC含量、Tm（熔解温度）和产物大小，使得用户可以根据具体实验需求进行精细化的引物设计。 Primer-BLAST 𐟔 特点：Primer-BLAST整合了Primer3的引物设计功能和NCBIBLAST的特异性验证功能，实现了从引物设计到特异性验证的一站式服务。功能：用户只需输入目标模板的序列或Accession号，并设定相应的引物设计参数，Primer-BLAST即可自动设计出符合要求的PCR引物。设计好的引物程序将直接用BLAST进行特异性验证，确保引物在目标数据库中具有唯一性，避免因引物二聚体或非特异性扩增等问题导致的实验失败。 PrimerBank 𐟏抧‰𙧂𙯼š通过选择数据库类型、物种、输入GeneID等步骤即可得到引物，同时支持序列比对和引物检索。功能：一个经过验证的PCR引物公共资源库，包含超过306，800个经验证的引物，涵盖大多数已知的人类和小鼠基因，用户可以通过基因信息、mRNA和蛋白搜索引物。这些软件各有千秋，选择适合自己的工具能大大提高科研效率！

两款引物设计神器，轻松搞定！引物设计是分子生物学实验的关键步骤，选择合适的软件可以大大提高工作效率。以下是两款简单易用的引物设计软件，帮助你轻松搞定引物设计。 𐟔砓napGene SnapGene是一款功能强大的引物设计软件，特别适合初学者。它支持同源重组引物设计，步骤如下：载体线化：通过酶切或反向PCR方法将载体线性化。同源臂碱基：根据酶切位点选择合适的同源臂长度，注意顶部链直接复制，底部链选择5端到3端的序列。复制顶部链碱基：直接复制顶部链的碱基序列。复制底部链碱基：复制底部链的碱基序列。复制氨基酸：根据需要复制相应的氨基酸序列。复制图谱：生成引物设计的图谱。 𐟌 NCBI NCBI是另一款广受欢迎的引物设计软件，操作简单，功能全面。你可以根据自己的需求选择合适的引物设计方法，轻松完成引物设计。这两款软件各有特色，大家可以根据自己的喜好和需求选择学习。当然，如果你想要更全面的功能，不妨两款都试试，毕竟小孩子才做选择，大人当然是全都要！𐟘‰

如何用NCBI设计PCR引物：详细指南嘿，朋友们！今天我们来聊聊如何用NCBI官网来设计PCR引物。这个过程其实不复杂，但需要一点耐心。下面我会一步一步带你走完整个流程。方法一：用NCBI官网设计引物 𐟌 第一步：进入NCBI官网打开NCBI官网，找到“GENE”选项，输入你要的目的基因，然后点击“Search”。第二步：选择物种这一步很重要！一定要确认你选择的物种是正确的，不然后续步骤会出问题。第三步：进入详细页面点击目的基因，进入详细页面。第四步：找到mRNA和蛋白编码在详细页面中，找到“mRNA and Protein(s)”部分，点击“NM”（碱基代码），“NP”是蛋白编码，翻译时用。第五步：挑选引物点击“Pick Primers”按钮。第六步：设置引物设计条件这里有几个关键参数需要注意： PCR产品大小：建议在100-300bp之间。跨越外显子交界：引物必须跨越外显子-外显子交界。高级参数： GC含量（%）：40-60% Max Poly-x：3 Max 3'稳定性：5 Max GC在引物3'端：3% 第七步：获取引物点击“Get primers”按钮，通常选择第一对引物。这个过程可能会有点慢，所以你需要耐心等待。方法二：验证引物特异性 𐟔 复制正反引物，分别去BLAST。打开NCBI官网，点击“BLAST”，选择目的基因的种属。粘贴设计的引物碱基序列，选择Database中的“RefSeq RNA”进行BLAST。查看结果，确保“Query Cover”接近100%，“E Value”越小越好。选择扩增出来的基因，核对是否只能扩增出目的基因。方法三：用Primer-BLAST验证 𐟧슦‰“开Primer-BLAST页面。输入正反引物序列。下拉选择基因库和物种。查看结果，核对是否只能扩增出目的基因。小结 𐟓 设计PCR引物的过程其实不复杂，但需要细心和耐心。希望这篇指南能帮到你，祝你实验顺利！如果有任何问题，欢迎留言讨论哦！

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